Сэм Винчестер родился 2 мая 1983 года в семье Джона и Мэри Винчестеров. Сэм — второй ребёнок в семье, он младше своего брата Дина на 4 года и старше Адама на 7 лет. Назван в честь своего деда по матери Сэмюэля Кэмпбелла. Дин — единственный, кому позволено называть его «Сэмми». Кроули же, наоборот, называет его 《лосярой》
После того, как семья встала на путь охотников, Сэм часто занимался поиском информации по сверхъестественным существам и способам борьбы с ними. Как правило они охотились на призраков и рядовых монстров, с демонами пересекались редко.
В знак протеста против желания отца воспитать его как охотника за демонами Сэм покинул дом и поступил в Стэнфордский колледж, где познакомился с Джессикой Мур и влюбился в неё. Обучение шло успешно. В частности, Сэм набрал 174 балла на экзамене LSAT, который выявляет логические способности студента и его умение вести беседу. Экзамен проводится четыре раза в год и является обязательным для всех юридических школ США.
Уход Сэма привёл к серьёзной ссоре с отцом, потому что тот был против его поступления в университет. Их отношения ещё долгое время были далеки от идеальных, но в конце концов, они простили друг друга. Смерть любимой девушки вынудила Сэма отправиться в дорогу с братом в поисках пропавшего отца. Однако для Сэма главным было отомстить демону, виновному в смерти матери и Джессики, и лишь потом истребление сил зла и спасение людей стало для него смыслом жизни.